Bpde致癌相关基因的全基因组筛选方法

来自 : 发布时间：2024-05-04

专利名称：Bpde致癌相关基因的全基因组筛选方法技术领域：本发明属于生物工程领域，具体的说涉及一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法。背景技术：随着社会经济的飞速发展，环境污染已成为人们所面临的一个严峻问题，生活在工业 国家或地区的人们普遍面临着由化学物质引起诱变、致癌或致畸的危险。肿瘤，尤其是恶 性肿瘤，严重危害着人类的健康及生命，很多国家为此投入了巨大的人力和物力，但迄今 肿瘤的危害仍未能被遏制。近几年来，很多国家恶性肿瘤发病率节节攀升。在我国，恶性 肿瘤死亡率已高居死因第一位。肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，我国肺癌的发病率和 死亡率一直呈明显上升趋势，有报告预计，到2025年，我国每年仅死于肺癌的人数将接近 100万。因此开展恶性肿瘤防治研究对于预防恶性肿瘤的发生，降低发生率，减少死亡率， 指导临床和提高肿瘤患者的生存质量等都具有十分重要的现实意义。经过长期的探索和研 究，尤其是近20年来癌基因和抑癌基因的发现，使得人们认识到肿瘤其实是一种基因分子 疾病。肿瘤的发生是一个多因素作用、多基因参与、经过多个阶段才最终形成的极其复杂 的生物学现象。人类肿瘤中，绝大部分是环境致癌因素与机体基因相互作用的结果。化学 性和生物性致癌因素是肿瘤病因中的重要环境因素。化学致癌物在酶系统作用后，经代谢 活化产生有致癌活性的终致癌物，其亲电子基团能与细胞耙器官——生物大分子如DNA中 的亲核基团经共价键结合，形成化学性质稳定的产物即加合物，导致DNA的突变，造成遗 传性危害。但目前对环境化学致癌物靶基因作用位点的了解尚不能阐明环境化学致癌物的 致癌分子机制。苯并[oc]芘(benzo[a]pyrene， BccP)是一种广泛存在于人们生活环境中的多环芳烃类环 境污染物，主要由含碳物质的不完全燃烧产生，存在于煤烟、香烟的烟雾、熏烤食品、汽 车排出的废气中，致癌性强，与人类肺癌的发生有关。BaP是间接致癌物，需在体内代谢 活化才具有强烈的致癌作用。反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7，8-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo(cc)pyrene， BPDE]是BctP的活性代谢终产物之一，致癌活性最强，具有亲电子性，可 与DNA的亲核位点共价结合形成BPDE-DNA加合物，引起DNA碱基突变，在化学诱变 和肿瘤发生中起关键作用。但其具体致癌机制仍不十分清楚。文献表明，BPDE可能通过引起p53、 k-ras、 c-myc、 bcl-2等多种基因的突变而引发肿 瘤。目前已知的与BPDE相互作用的基因尚不能阐明BPDE的致癌分子机制，寻找出更多 的BPDE致癌易感基因是个亟需解决的问题，而如何寻找更多的BPDE耙基因作用位点又 成为其中的关键。人类基因组研究发现人类基因数目约为3.4万至3.5万个，如此众多的基因，究竟哪个或哪几个基因是这些致癌物的特异靶作用位点？又如何高通量筛选出致癌物 特异的靶基因作用位点？目前，对各种生命奥秘和疾病相关基因的分离和鉴定已成为功能基因组学的研究热点，已发展多种技术方法寻找差异表达基因，如差异显示PCR (DD-PCR)方法、基因芯片技 术、基因表达的系统分析(SAGE)、消减杂交法等，这些方法都能有效分离差异基因，但 又存在其自身的缺点和局限性。如DD-PCR的假阳性率高，获得的片段较短，提供的基因 信息比较有限，同位素有污染和伤害问题；基因芯片技术的杂交和洗涤条件较难把握，会 导致一定的假阳性或假阴性率，分析图像和数据较耗时；SAGE则克隆过程比较繁琐；消 减杂交法虽可获得低丰度的差异基因，但不能同时展示所有的基因及差异基因。扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是新近发展起 来的一项DNA指纹技术，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生DNA限制性片段， 用双链人工接头连接到限制性片段的两端形成的特异性片段作为模板，在接头序列和内切 酶识别位点的基础上加上一定数目(1~3个)的选择性碱基设计引物，只有那些限制性位 点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增，可以在不需要知道 DNA序列信息的前提下，对酶切片段进行传统的PCR扩增，将酶切限制性片段的可靠性 和PCR技术的快捷方便结合在一起，克服了 RFLP和RAPD技术中的一些不足而兼具两者 的优点。由于AFLP可用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此， 理论上AFLP可以产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组，是指纹图谱中多态性最丰富 的一项技术，且具有准确性高，重复性好，结果可靠等特点，是检测基因组变异较为理想 的一种方法，已广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。 Majima等应用AFLP技术成功分离克隆出了一条与大鼠肾癌早期发生有关的候选新基因一 ^Niban基因。也有学者应用AFLP技术检测了小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传 改变，检测到4条差异片段，认为AFLP技术适用于肿瘤易感基因的筛选。AFLP筛选是基 因组水平基因分型的一个策略，已广泛应用植物和细菌方面，但应用于人类的报道还很少 见。Wong等首次应用毛细管电泳AFLP技术进行人肿瘤的分类和鉴别诊断，成功分类了 16个肿瘤样品，而这些样品用比较基因组杂交并没有检测到基因组的变异，表明毛细管电 泳AFLP技术是进行肿瘤筛选和诊断的有应用前景的方法。Matsunaga等应用AFLP差异显 示技术对肺癌组织和肺癌病人外周血的基因转录产物进行鉴定，发现了 4个差异转录产物， 并用这4个转录产物和细胞角蛋白19作为新的指标对肺癌病人分期进行评价，有助于肺癌 病人的早期诊断、分期和随访，改善肺癌病人的预后和提高生存率。因此，AFLP结合其他 分子生物学技术可以用于肿瘤易感基因的筛选和鉴定。AFLP采用特定引物扩增，退火温度 高，使假阳性率降低，特异性和可靠性增高，因而具有准确性高，重复性好，结果可靠等 特点，而且可以在不知道基因组序列特点的情况下对其进行扩增，利用少量的内切酶组合 建立一系列AFLPDNA，可以涵盖所有的基因组序列，用不同的引物组合来筛选这些AFLP 片段中的感兴趣的序列，理论上可以将基因组中的这些感兴趣的序列全部富集筛选出来，被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标记。研究表明，BPDE与DNA相互作用形成BPDE-DNA加合物进而引起DNA碱基的突变， 可能与DNA特定的位点有关或者是具有明显的DNA碱基序列或构象的特异性。利用这个 特点，我们设计了在体外使BPDE抗原与DNA双酶切片段相互作用，BPDE抗原与DNA 的特异作用序列结合制备形成BPDE抗原-DNA特异作用序列加合物。然后用针对BPDE 抗原的特异性单克隆抗体与纳米磁颗粒耦联成免疫纳米磁颗粒，把与BPDE相互作用并结 合的特异DNA片段从未结合的DNA片段中分离出来，找出可能致癌的与BPDE作用的特 异DNA片段。此过程中，关键的问题是如何把特异的DNA片段进行初步富集并分离出来。 以纳米磁颗粒和抗原抗体反应为基础的免疫磁性分离(immunomagnetic separation, IMS) 技术，由于具有巨大的比表面积、高吸附特性，及灵敏度高、特异性强、重复性好、分离 效果好、简便快速等优点，已用于微生物、细胞以及其他目的物质的富集和分离，已成为 一种有效的富集、分离和纯化工具。但免疫磁性分离技术应用于核酸片段的分离和富集尚 未见报道。把AFLP技术和IMS技术相结合应用于肿瘤易感基因的筛选亦尚未见报道。我 们利用抗原抗体反应的高特异性和纳米磁颗粒的巨大比表面积、高吸附特性、高灵敏性、 重复性好、分离效果好、简便快速等优点，对特异的DNA片段成功进行了初步富集和分离， 解决了实验中的一个关键问题，并为后续的AFLP-PCR进一步的扩增富集提供了物质基础。 由于能与BPDE相互作用的特异DNA片段可能很少，且我们并不能事先知道与BPDE 相互作用的特异DNA片段的序列特点和碱基组成，如何使这些片段进一步扩增和富集成为 实验中的另一个关键问题。应用AFLP技术正好可以解决这一问题，从而对初步富集分离 的与BPDE相互作用的特异DNA片段进行大量特异性扩增，为后续实验提供条件。进而 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而富集、分离、扩增、回收、克隆测序BPDE作用位点 的特异DNA片段的核苷酸序列，经同源相似性分析获得与其同源的已知基因或未知核苷酸 序列。 \' 发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选 方法。本发明的技术方案概述如下BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤 (1)从正常肺组织中提取基因组DNA;〖2) AFLP DNA片段的制备基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；G)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离AFLP DNA片段与BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分离出来；(4) AFLPPCR扩增AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；(5) AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；(6) 差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。优选的是所述AFLP DNA片段的制备为(1) 用TaqI消化准备4-6个反应体系，每个反应体系总体积为20 pl，其中包括DNA300 ng， Taq I 10u， 1 Xbuffer,其中1 Xbuffer的成分终浓度为50 mM Tris-HCl pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50mMNaCl，混匀后，65。C恒温水浴消化l-3 h;(2) 向每一反应体系中补加Pst I 10u， 37。C恒温水浴消化l-3 h后，70 75。C水浴10 20 min 灭活酶的活性，4 8\'C保存备用；(3) 1.5。/。琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。优选的是所述与BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为(1) 纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断1) 取所述AFLPDNA片段20pl，分成4组放入试管中免疫磁性特异分离组、免疫磁性 非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；2) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2 mmol/L的BPDE 0.5~2 pl，其余各组分别 加入0.5-2 ^灭菌超纯水，37\'C避光孵育3~7 d;3) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10 : 4的乙酸乙酯和乙醚20~22 ^， 轻摇混匀，静置l 4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复2-4次，纯化、沉淀 DNA-BPDE加合物，力B 20 pl水重悬DNA-BPDE加合物；4) 向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳 米磁性颗粒0.5~2 |_d，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒0.5 2 W，向所述正 常对照组中加入灭菌超纯水0.5 2 pl，室温、避光、轻摇10 30min;5) 把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2 5min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上 清液，用灭菌超纯水30 40nl洗2 4次，每次2 5min;6) 加5 jal灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒 复合物溶液；(2) AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLPDNA片段免疫纳米磁颗粒复 合物溶液的试管放入沸水浴中10 15 min，然后8000 11 000 r/min离心5 10 min， 收集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相 互作用的AFLPDNA片段，-2CTC冻存备用。所述针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为(1) 取裸纳米磁颗粒330ial，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中；(2) 在磁场作用2 5min，吸弃上清；(3) 取O.l mol/LpH7.8,磷酸缓冲液330 pl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体 500(4) 20 25\'C孵育10 20min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为lmg/ml;(5) 在避光条件下，4 8\'C孵育10-16 h，不时轻轻颠倒；(6) 把离心管放入磁分离架作用2~5 min，吸弃上清；(7) 向管中加330 plpH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20-25\'C孵育5~10 min，轻轻颠倒；(8) 重复步骤(6)、 (7)各2次；(9) 把离心管放入磁分离架作用2~5 min，吸弃上清；(10) 从分离架上取出离心管，加入330)alpH7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒一抗体耦 合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；所述AFLP PCR扩增的歩骤为(1) AFLP-DNA片段与接头的连接连接反应体系总体积为20 W，其中包括AFLP-DNA片段5 jal， Taq I接头5 pmol， Pstl接头2pmo1， T4DNAligase400u， IXbuffer,其中1 Xbuffer的成分终浓度为50mM Tris-HCl， 10mMMgCl2， 10mMDTT， lmMATP， 25吗/mlBSA， pH7.5;连接反应条件为 16~25°C l~4h， 70°C 5~15min， 4 8。C保存；所述Taql接头为5\'隱GACGATGAGTCCTGA G -3\' 3\' - TACTCAGGACTCGC-5\' Pstl接头为5\' -GACGTGACGGCCGTCATGCA-3\' 3\' -GCACTGCCGGCAG T -5\'(2) AFLP预扩增PCR:AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20 pl，其中包括从所述步骤(1)获得的连接 产物1 pl， Taq I预扩增引物5 pmol， Pst I预扩增引物5 pmol， 1 XTaq PCR MasterMix， 其中IX Taq PCR MasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进行 PCR扩增反应:94°C 0.5~lmin， 56°C 0.5~2min， 72°C 0.5~2min， 20~40个循环后，72 °C 5~15 min， AFLP预扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀 释20 50倍，4 8\'C保存备用；所述Taql预扩增引物为5\' -GATGAGTCCTGAG CGAA-3\' Pstl预扩增引物为 5\' -GACGGCCGTCATGCAGA-3\'(3) AFLP选择性扩增PCRAFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20 pl，其中包括AFLP预扩增PCR产物 稀释液lpl， Taql选择性扩增引物5 pmol, Pst I选择性扩增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix,其中1 X Taq PCR MasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH8.3 ， 50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按 下述条件进行PCR扩增反应 94°C 0.5 lmin， 65°C 0.5~lmin， 72°C 0.5~2min，其 中退火温度从65t:开始每循环降低0.7X:，共12个循环，12个循环后反应条件变为94 °C 0.5~lmin， 56°C 0.5~lmin， 72°C 0.5~2min ， 20 30个循环后，72°C 5~15min， AFLP 选择性扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4~8\"保存，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引物为4条，Pst I选择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合。 所述4条Taq I选择性扩增引物分别为Taql选择性扩增引物1 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAACG-3\' Taql选择性扩增引物2 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3\' Taql选择性扩增引物3 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3\' Taq I选择性扩增引物4 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3\' 所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为Pstl选择性扩增引物15\' -GACGGCCGTCATGCAGAGC-3\'5\' -GACGGCCGTCATGCAGATG-3\' 5\' -GACGGCCGTCATGCAGACT-3\' 5\' -GACGGCCGTCATGCAGAAC-3\' 5\' -GACGGCCGTCATGCAGATT-3\'Pstl选择性扩增引物2 Pstl选择性扩增引物3 Pstl选择性扩增引物4 Pstl选择性扩增引物5 所述20对引物组合分为1 23 456789 10 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P3T1 P3T2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20P3T3 P3T4 P4T1 P4T2P4T3 P4T4 P5T1 P5T2 P5T3 P5T4所述AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为(1) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与 上样缓冲溶液的体积比为8 : 3制成上样混合物;经60W恒功率预电泳20 50min后，取3 6pl上样混合物加样到6%变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120 150min，亦即至 二甲苯青FF指示带距凝胶底部2~5cm时终止电泳；(2) 变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色1) 电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振荡10 30 min或至指示剂完全消失；2) 用超纯水振荡洗胶2 4次，每次2 5min;3) 把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液的成分为含有1 g/L硝酸银、1.5ml/L37。/。甲醛的 水溶液，充分振荡20 40 min;4) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5 10 s，立刻将凝胶转移至l L预 冷的显色液中，显色液的成分为含有30 g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5ml/L37。/o甲 醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把 新鲜的1L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2 3 min，或直至所有条带出现；5) 待凝胶完全显色后，加入l L固定溶液，振荡2 3 min，终止显色反应，固定凝胶；6) 在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2 5 min;7)将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果；所述差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为(1) 差异片段DNA的回收 用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水30~40 pl，置沸水浴中10~20 min，然后3 000~8 000 r/min离心5~10 min，收集上清液备用；(2) 回收差异片段DNA的PCR再扩增PCR再扩增的反应体系总体积为50 其中包括差异片段DNA的回收上清液7 jliI， Taq I选择性扩增引物lOpmol， Pst I选择性扩增引物lOpmol， 1 XTaq PCR MasterMix，其 中1 X Taq PCR MasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/LMgCl2, 250 |imoI/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进行PCR 扩增反应94。C 0.5~2min，56~65°C 0.5~lmin， 72°C 0.5 2min，25~40个循环后，72。C 5~15 min，经1.5。/。琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，4 8。C保存；(3) 克隆回收差异片段DNAPCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连 接有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞， 使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体 积为20pl，其中包括T载体质粒重组子.6nl， SalI10u， Xba IlOu, lXbuffer,混匀后，37 °C l~3h， 70°C 5~15min;T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，可 见2 681 bp和ll+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段 DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；(4) 同源相似性检索分析将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库 中进行同源相似性检索分析。 本发明的优点本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，为一高效、特异的方法，在 全基因组水平筛选出更多的BPDE致癌易感基因，为阐明BPDE的致癌分子机制打下基础。 图1为本发明一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法的流程图。 图2为免疫磁性分离程序。图3为小鼠肺组织基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。图4为小鼠肺组织基因组DNA双酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图5为AFLP预扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图6为AFLP选择性扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图7为不同引物组合选择性扩增PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带图谱。图8为免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P3T3) PAGE条带图谱。图9为免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P5T3、 P4T3) PAGE条带图谱。图10为回收差异条带PCR再扩增产物琼脂糖电泳。图11为回收差异条带PCR再扩增产物琼脂糖电泳。图12为T-A克隆的Xba\'I和Sal I双酶切鉴定。具体实施例方式研究方法本研究首次应用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)与免疫纟内米磁性分离(immunomagnetic separation, IMS)技术相结合的 方法，以小鼠为例，对小鼠全基因组DNA与BPDE相互作用的基因位点进行筛选，对差 异片段进行了回收、再扩增、克隆测序及BLAST同源相似性检索分析，获得与差异片段核 苷酸序列同源的已知基因或未知核苷酸序列。本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法的流程见图1。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例1一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤(1) 从正常肺组织中提取基因组DNA;(2) AFLP DNA片段的制备基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；(3 )与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离AFLP DNA片段与BPDE 孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作 用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分离出来；(4) AFLPPCR扩增AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；(5) AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；(6) 差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。 实施例2小鼠肺组织基因组DNA的提取1、 主要仪器台式高速冷冻离心机(UNIVERSAL 32R,德国Hettich公司)、Beckman Du530分光光度计 (德国Beckman公司)、紫外分析仪(上海康华仪器制造厂)、高纯水装置SCD-II (军事 医学科学院卫生装备研究所)2、 主要材料和试剂BALB/c小鼠(军事医学科学院实验动物中心)、DNA提取试剂盒(北京天为时代)、蛋白 酶K (大连宝生物工程有限公司)、无水乙醇(AR，天津市审泰化学试剂有限公司)、琼脂 糖(大连宝生物工程有限公司)、DNAMarker (大连宝生物工程有限公司)3、 主要试剂的配制(1) PBSpH7.4的配制NaC18.0g， KCl 0.2 g， KH2P04 0.2 g， Na2HP04 12H20 2.9 g，超 纯水900 ml，调pH值为7.4，加水至1000 ml，高压后备用。(2) 10 mol/L NaOH的配制400 g NaOH溶于450 ml H20中，补H20至1 L。(3) 0.5 mol/L EDTA的配制186.1 g Na2EDTA 2H20溶于700 ml H20中，加热、磁力搅 拌使溶解加快，用10 mol/LNaOH调至pH8.0(约40 ml)，补加H20至1 L。(4) 5XTBE的配制54gTris， 27.5g硼酸，20 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，加水至1 L。 4、方法歩骤 -按DNA提取试剂盒说明书进行以下步骤(1) 取小鼠肺组织少许，PBS冲洗血液，放入匀浆器后加少许PBS制成细胞悬液，10 000 r/min离心1 min，弃上清。加200 pi缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入200 pi蛋白酶K(20 mg/ml)，混匀，置55\'C水浴中至组织溶解，约需3 h。(2) 加220 pi缓冲液GB，混匀，70°C水浴10min，溶液变清亮。(3) 加220 nl无水乙醇，混匀，有絮状沉淀出现。(4) 将溶液及沉淀转移至一个吸附柱CB中，将吸附柱CB放入废液收集管，12 000 r/min 30 s，弃滤液。(5) 加入500 pi去蛋白液GD， 12 000 r/min离心30 s，弃滤液。(6) 加700 (til漂洗液GW， 12 000 r/min离心30 s，弃滤液。(7) 加500 pi漂洗液GW， 12 000 r/min离心30 s，弃滤液。(8) 再离心，12 000 r/min 2 min，尽量除去漂洗液。(9) 将CB转入一个干净的离心管中，向CB中加入100 ^洗脱缓冲液TE(70\'C水浴预热)， 混匀，室温放置2 5min， 12 000 r/min 30 s。(10) 离心得到的溶液再次加入吸附柱CB中，室温放置2 min， 12 000 r/min 2 min,得到 DNA溶液。(11) 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、完整性及产量。(12) Beckman分光光度计检测DNA纯度及含量，分装成小份，-20°〇保存备用。见图3。图 中，M: DNA Marker DL2000; 1~3:小鼠肺组织基因组DNA实施例3双酶切制备AFLP DNA片段1、 主要仪器电热恒温水浴箱(天津市华北实验仪器厂)2、 主要试剂小鼠肺组织DNA、Taq I核酸内切酶(美国Invitrogen公司)、Pst I核酸内切酶(美国Invitrogen 公司)3、 方法步骤(1)首先用TaqI内切酶消化。其中设不加核酸内切酶的管作为对照。 反应体系如下Taq I 1 pi10Xbuffer 2 jal0.1%BSA 2jJ DNA 1 piddH20 14)jJ - Total 20 pi反应条件放入恒温水浴箱，65\'C恒温水浴消化2h; (2)然后进行下述操作，向每一反应体系中补加5 ^含Pst I的反应液Pstr 1H10X bufferddH20 2 ^Total 5 nl反应体系总体积为25反应条件放入恒温水浴箱，于37\'C水浴消化2h后，70\'C水浴10min灭活核酸内切酶的 活性，4。C保存备用。见图4，图中M: DNA Marker DL2000; 1~2: DNA对照；3 4: DNA双酶切后。 实施例4AFLPDNA片段的制备为(1) 用TaqI消化准备4个反应体系，每个反应体系总体积为20 pl，其中包括DNA300 ng， Taql 10u， 1Xbuffer，其中IXbuffer的成分终浓度为50 mM Tris-HC1 pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50mMNaCl，混匀后，65\'C恒温水浴消化1 h;(2) 向每一反应体系中补加PstI 10u， 37。C恒温水浴消化l h后，72\'C水浴20min灭活酶 的活性，6\'C保存备用；(3) 1.5。/。琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。 实施例5AFLP DNA片段的制备为(1) 用TaqI消化准备6个反应体系，每个反应体系总体积为20 pl，其中包括DNA300 ng， Taql 10u， IXbuffer,其中l Xbuffer的成分终浓度为50 mM Tris-HCl pH 8.0，OmM MgCl2， 50mMNaCl，混匀后，65。C恒温水浴消化3 h;(2) 向每一反应体系中补加PstI 10u， 37\'C恒温水浴消化3h后，75t水浴10 min灭活酶 的活性，8\'C保存备用；(3) 1.5W琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。 实施例6与BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为 (一)、免疫纳米磁性颗粒的制备 1、主要材料和试剂纳米磁颗粒(本实验室自制)、磁分离架(本实验室研制)、BPDE单克隆抗体(monoclonal antibody to benzo(a)pyrene diol epoxide, clone 8E11 )(荷兰Hycult公司)、BSA (美国Sigma公司)2、 主要试剂的配制(1) 0.1 mol/LpH7.8磷酸缓冲液(PB)的配制A液(0.2 mol/LNa2HP04): Na2HP04 \'12H20 7.164 g加水溶解后定容至100 ml; B液(0.2 mol/LNaH2P04): NaH2P04 2H20 3.121 g加 水溶解后定容至100 ml; A液91.5 ml和B液8.5 ml混合，调pH值为7.8，即成0.2 mol/L PB， 稀释一倍，得到0.1 mol/LpH7.8磷酸缓冲液(PB)。(2) PBS pH7.4的配制NaCl 8.0 g， KC1 0.2 g， KH2P04 0.2 g, Na2HP04 12H20 2.9 g，超 纯水900 ml，调pH值为7.4，加水定容至1 000 ml，高压后备用。3、 方法(1) 取裸磁颗粒330ial加入一干净灭菌的1.5ml离心管中。(2) 放入磁分离架中在磁场作用1 min,吸弃上清，把离心管移出磁分离架。(3) 重悬裸磁颗粒取0.1 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(PB)330 pi重悬裸磁颗粒，再加入BPDE 单克隆抗体500 W。(4) 室温孵育15min，然后加入BSA至终浓度为0.1% (W/V)。(5) 在避光条件下，4\'C孵育过夜，不时轻轻颠倒。(6) 把离心管放入磁分离架作用1 min,吸弃上清。(7) 向管中加330plpH7.4PBS，用移液器枪头轻轻吹打混匀，室温孵育5 min，轻轻颠倒。(8) 重复步骤(6)、 (7)各2次。(9) 把离心管放入磁分离架作用lmin，吸弃上清。(10) 从分离架上取出离心管，加入330 plpH7.4PBS，重悬磁颗粒一抗体耦合物，即成针 对BPDE的免疫纳米磁性颗粒。(二)、 AFLPDNA片段的免疫纳米磁性富集、分离1、 主要试剂BPDE[ Benzo(a)pyrene-r-7，t-8-dihydrodiol-t-9，10-epoxide(±) (anti)](美国国家癌症研究所化 学致癌物标准品贮藏室)、四氢呋喃(Tetrahydroftiran， THF)(美国Sigma公司)、AFLP DNA 片段、针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒2、 主要试剂的配制BPDE溶液的配制称BPDE 5.2 mg ，加入8.6 ml THF溶解，即可配制成2 mmol/L的BPDE 四氢呋喃溶液，-20^保存备用。 .3、 方法(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断1) 取AFLPDNA片段20 ^U，共4管，分成4组免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异 吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组。2) 为了获得BPDE-DNA片段，参照文献并略做改动，向免疫磁性特异分离组的试管中加 入2 mmol/L的BPDE 0.5 pl，其余各组分别加入0.5 |al灭菌超纯水，37\'C避光孵育1周。3) 参照文献并略做改动萃取免疫磁性特异分离组中未结合的BPDE，即向免疫磁性特异分 离组的管中加入乙酸乙酯和乙醚(10:4， V:V) 20)il，轻摇混匀，静置3min，除去上层液相，重复2次，然后根据《分子克隆实验指南》中的方法，纯化、沉淀DNA-BPDE， 最后加20 pl水重悬DNA-BPDE。4) 向免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性 颗粒lpl，向裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒1 pl，向正常对照组中加入灭菌超纯水 1 Hl，室温、避光、轻摇20min。5) 把各试管放入磁分离架上，在磁场作用5 min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清 液，用灭菌超纯水30pl洗2次，每次3min。6) 加5 ^灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒 复合物溶液。(2) AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离把步骤(1)中得到的盛有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合 物溶液的试管放入沸水浴中10 min，然后11 000 r/min离心10 min，收集上清液，即含有 与BPDE相互作用的AFLPDNA片段，-2(TC冻存备用。步骤见图2。 实施例7针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为(1) 取裸纳米磁颗粒330 pl，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中；(2) 在磁场作用2min，吸弃上清；(3) 取0.1 mol/LpH7.8磷酸缓冲液330 pl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500(4) 20\'C孵育20 min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为lmg/ml;(5) 在避光条件下，8t:孵育10h，不时轻轻颠倒；(6) 把离心管放入磁分离架作用2 min，吸弃上清；(7) 向管中加330 plpH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，25\'C孵育10min， 轻轻颠倒；(8) 重复歩骤(6)、 (7)各2次；(9) 把离心管放入磁分离架作用2 min，吸弃上清；(10) 从分离架上取出离心管，加入330plpH7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒一抗体耦合 物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；实施例8针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为(1) 取裸纳米磁颗粒330 加入一干净灭菌的L5ml离心管中；(2) 在磁场作用5 min，吸弃上清；(3) 取0.1 mol/LPH7.8磷酸缓冲液330 pl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500(4) 25。C孵育10min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为lmg/ml;(5) 在避光条件下，4。C孵育16h，不时轻轻颠倒；(6) 把离心管放入磁分离架作用5 min，吸弃上清；(7) 向管中加330plpH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20\'C孵育5min， 轻轻颠倒；(8) 重复步骤(6)、 (7)各\'2次；(9) 把离心管放入磁分离架作用5 min，吸弃上清；(10) 从分离架上取出离心管，加入330 plpH7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒一抗体耦合 物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；实施例9与BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为 (1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断1) 取所述AFLP DNA片段20 pl，分成4组放入试管中免疫磁性特异分离组、免疫磁性 非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；2) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDEl W，其余各组分别加入1^1 灭菌超纯水，37\'C避光孵育5d;3) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10 : 4的乙酸乙酯和乙醚21 pl，轻摇 混匀，静置1 min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复3次，纯化、沉淀DNA-BPDE 加合物，加20jal水重悬DNA-BPDE加合物；4) 向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米 磁性颗粒1 ial，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒1 ^，向所述正常对照组中加 入灭菌超纯水ljal，室温、避光、轻摇10min;5) 把各试管放入磁分离架上，在磁场作用3 min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清 液，用灭菌超纯水35pl洗3次，每次2min;6) 加5 pl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒 复合物溶液； ，(2) AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复 合物溶液的试管放入沸水浴中13 min，然后8000 r/min离心5 min，收集上清液，使 AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-2(TC冻存备用。 实施例10与BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分离的歩骤为 (1 )纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断1) 取所述AFLP DNA片段20 )^，分成4组放入试管中免疫磁性特异分离组、免疫磁性 非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；2) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2 mmol/L的BPDE2 pl，其余各组分别加入2 pl 灭菌超纯水，37\'C避光孵育3d;3) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10 : 4的乙酸乙酯和乙醚22 (al，轻摇 混匀，静置4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复4次，纯化、沉淀DNA-BPDE 加合物，加20 pl水重悬DNA-BPDE加合物；4) 向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米 磁性颗粒2 ^，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒2 iul，向所述正常对照组中加 入灭菌超纯水2pl，室温、避光、轻摇30min;5) 把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2 min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清 液，用灭菌超纯水40jiil洗4次，每次5min;6) 加5 ^灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒 复合物溶液；(2) AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复 合物溶液的试管放入沸水浴中15 rain，然后10000 r/min离心8 min，收集上清液，使 AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-20。C冻存备用。 实施例11 AFLP PCR扩增1、 主要仪器PCR仪(Mastercycler personal 5332，德国Eppendorf公司)2、 主要材料和试剂(1) 与BPDE相互作用的AFLP DNA片段(从步骤(二)获得〕。(2) 人工接头由宝生物工程(大连)有限公司DNA合成中心合成，包括核心序列及限制性 内切酶特定序列两部分。核心序列 酶特定序列 Taql接头5\' -GACGATGAGTCCTGA G -3\'3\' -TACTCAGGACT CGC-5\' Pstl接头5\' -GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3\'3\' -GCACTGCCGGCAG T -5\'(3) T4 DNA连接酶 (400 u/pl) (NEB， New England BioLabs)(4) 根据接头序列设计AFLP预扩增引物及选择性扩增引物，引物包括三部分，即5\'端与人 工接头序列互补的核心序列(core sequence, CORE)、限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence, ENZ)禾B 3\'端有选择性碱基的粘性末端(selective extention， EXT)，预扩增引物 有一个选择碱基，选择性扩增引物有三个选择碱基。引物由宝生物工程(大连)有限公司DNA 合成中心合成。AFLP预扩增引物核心序列 酶特定序列 选择碱基Taql预扩增引物 5\' Pstl预扩增引物 5\' 选择性扩增引物-GATGAGTCCTGAG CGA -GACGGCCGTCA TGCAGA-3\' A-3\' 核心序列酶特定序列选抒碱基Taql选择性扩增引物15\'-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3\'Taql选择性扩增引物25\'-GATGAGTCCTGAGCGAATG-3\'Taql选择性扩增引物35\'-GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3\'Taql选择性扩增引物45\'-GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3\'Pst I选择性扩增引物15\'-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3\'Pstl选择性扩增引物25\'-GACGGCCGTCATGCAGATG-3\'Pstl选择性扩增引物35\'-GACGGCCGTCATGCAGACT-3\'Pstl选择性扩增引物45\'陽GACGGCCGTCATGCAGAAC-3\'Pstl选择性扩增引物55\'-GACGGCCGTCATGCAGATT-3\'选择性扩增引物两两组合可形成20对引物组合，如下:I 2 3 4 5 6 7 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P2T1 P2T2II 12 13 14 15 1689 10 P2T3 P2T4 P3T1 P3T2 17 18 19 20P3T3 P3T4 P4T1 P4T2 P4T3 P4T4 P5T1 P5T2 P5T3 P5T4(5) 2X Taq PCR MasterMix (北京天为时代)3、 主要试剂的配制接头和引物的溶解及稀释向盛接头或引物的管内加10倍接头或引物nmol数体积的 ddH20溶解接头或引物，然后取lpl至另管，加19plddH20，结果，每pl液体中含接头或 引物为5 pmol，即接头或引物的浓度为5 pmoI/L。4、 方法(1) AFLP-DNA片段与接头的连接 连接反应体系10xbuffer AFLP-DNA片段 T4 DNA ligase Taq I接头 Pst I接头 ddH20 Total2 |ul 5 ^1 )Ul1 pi 0.4 nl 10.6 ^ 20 )nl连接反应条件22°C 2h， 70°C 10min， 4。C保存。 (2) AFLP预扩增PCRAFLP预扩增PCR反应体系Taql预扩增引物 1 piPstl预扩增引物 1^il 迮接产物 1 )J2 X Taq PCR MasterMix 12.5 |ilddH20 9.5 |JTotal 25 piAFLP预扩增PCR反应体系终浓度为10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 50匪ol/L KC1 1.5 mmol/L MgCl2 250 ,ol/L dNTP each lu Taq polymerase/10 (il AFLP预扩增PCR反应条件1.94°C 3min; 2. 94°C 30 s， 3.56°C 60s，4. 72°C 60s，5. go to 2， repeat 23 cycles;6. 72°C lOmin. 7.4°C hold.AFLP预扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀释20倍，4 r保存备用。见图5，图中，M: DNA Marker DL2000; 1:正常对照组；2:裸磁颗粒非特 异吸附组；3:免疫磁性非特异吸附组；4:免疫磁性特异分离组(3) AFLP选择性扩增PCR AFLP选择性扩增PCR反应体系预扩增产物稀释液 1 ^Taq I选择性扩增引物 1 piPstl选择性扩增引物 1^1 2 x Taq PCR MasterMix 12.5 piddH20 9.5 ^Total 25 piAFLP选择性扩增PCR反应条件 1.94°C 3min; 2. 94\'C 30 s,3.65。C 30 s (-0.7°C/cycle)，4. 72°C 60s，5. go to 2， repeat 12 cycles; 6.94°C 30 s，7. 56\'C 60s，8. 72°C 60s，9. go to 6， repeat 22 cycles;10. 72。C lOmin; 11.4。C Hold.AFLP选择性扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实有条带见图6，然后进行变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳。图中，M: DNA Marker DL2000; 1:正常对照组；2:裸磁颗粒非特异 吸附组；3:免疫磁性非特异吸附组；4:免疫磁性特异分离组 实施例12 AFLP PCR扩增(1) AFLP-DNA片段与接头的连接连接反应体系总体积为20 )nl，其中包括AFLP-DNA片段5 pl， Taq I接头5 pmol， Pst I接头2 pmol， T4 DNA ligase 400u， 1 X buffer,其中1 X buffer的成分终浓度为50mM Tris-HCl， 10mMMgCl2， lOmMDTT， lmMATP， 25pg/mlBSA， pH7.5;连接反应条j牛为 16~25°C l~4h， 70°C 5~15 min， 4 8。C保存；所述Taql接头为 5\' -GACGATGAGTCCTGAG -3\' 3\' - TACTCAGGACTCGC-5\' Pstl接头为 5\' -GACGTGACGGCCGTCATGCA-3\' 3\' -GCACTGCCGGCAG T -5\'(2) AFLP预扩增PCR:AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20 |al，其中包括从所述步骤(1)获得的连接 产物lfil, Taq I预扩增引物5pmol， Pst I预扩增引物5 pmol， 1 XTaqPCRMasterMix，其 中1XTaqPCRMasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH8J， 50mmol/LKCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 |imol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进行 PCR扩增反应 94°C 0.5~lmin, 56°C 0.5~2min， 72°C 0.5~2min， 20~40个循环后， 72°C 5~15 min， AFLP预扩增PCR产物经1.5°/。琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后， 稀释20 50倍，4-8\'C保存备用；所述Taql预扩增引物为 5\' -GATGAGTCCTGAG CGA A-3\'Pstl预扩增引物为 5\' -GACGGCCGTCATGCAGA-3\'(3) AFLP选择性扩增PCRAFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20 pl，其中包括AFLP预扩增PCR产物稀 释液1^1， Taql选择性扩增引物5 pmol， Pst I选择性扩增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix，其中1 XTaq PCR MasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH8.3， 50mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase，混匀后，按下 述条件进行PCR扩增反应 94°C 0.5~lmin， 65°C 0.5\"min， 72°C 0.5 2min，其中退 火温度从65\'C开始每循环降低0.7°C，共12个循环，12个循环后反应条件变为94°C 0.5 lmin， 56°C 0.5 ltriin， 72°C 0.5~2min ， 20 30个循环后，72°C 5 15 min， AFLP选 择性扩增PCR产物经1.5M琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4-8\'C保存，然后进行变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引物为4条，Pst I选 择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合，(可以选下面的4-20中的任何对的引物 组合完成本发明成为新的实施例) 所述4条Taq I选择性扩增引物分别为-Taql选择性扩增引物1 5\'Taql选择性扩增引物2 5\'Taql选择性扩增引物3 5\'Taql选择性扩增引物4 5\' 所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为--GATGAGTCCTGAGCGAACG-3\' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3\' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3\' 隱GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3\'Pstl选择性扩增引物15\'-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3\'Pstl选择性扩增引物25\'陽GACGGCCGTCATGCAGATG-3\'Pstl选择性扩增引物35\'-CBACGGCCGTCATGCAGACT-3\'Pstl选择性扩增引物45\'-GACGGCCGTCATGCAGAAC-3\'Pstl选择性扩增引物55\'-GACGGCCGTCATGCAGATT-3\'所述20对引物组合分为:123456了8910P1T1P1T2P1T3P1T4P2T1P2T2P2T3P2T4P3T1P3T211121314151617181920P3T3P3T4P4T1P4T2P4T3P4T4P5T1P5T2P5T3P5T4不同弓I物组合选择性扩增PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带见图7，图中， 1: P1T2; 2: P1T1; 3: P1T4; 4: P1T3; 5: P2T1; 6: P3T3; 7: P2T2; M: pBR322 DNA/MspI Marker; 8: P3T4; 9: P4T1; 10: P2T3; 11: P4T2; 12: P4T3; 13: P2T4; 14: P4T4;15: P5T1; 16: P5T2; 17: P5T3; 18: P5T4; 19: P3T1; 20: P3T2免疫磁性分离AFLP选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳见图8，图中，M: pBR322 DNA/MspI Marker; 1:正常对照组；2:裸纳米磁颗粒非特异吸附组；3:免疫纳米磁颗粒 非特异吸附组；4~7:免疫纳米磁颗粒特异分离组；注箭头所示为差异片段条带位置。 免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P5T3、 P4T3) PAGE条带见图9，图中， M: pBR322 DNA/MspI Marker; 84、 77:正常对照组；83、 76:裸纳米磁颗粒非特异 吸附组；82、 75:免疫纳米磁颗粒非特异吸附组；71~74、 78 81:免疫纳米磁颗粒特异分 离组；图中清楚可见有差异片段条带出现。 实施例13 AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的歩骤为 (一)、AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(变性PAGE)1、 主要仪器电脑三恒多用电泳仪DYY-12型(北京六一 电泳仪厂)、DNA序列分析电泳槽DXCZ-20B (北京六一电泳仪厂)2、 主要试剂亲禾口硅烷(PlusOne Bind-Silane) ( Amersham Bioscience ， Sweden )、 疏zK鞋烷(PlusOne Repel-Silane ES) (Amersham Bioscience, Sweden)、冰乙酸(glacial acetic acid) (GR，天津 市永大化学试剂开发中心)、95。/。乙醇(AR,天津市申泰化学试剂有限公司)、无水乙醇(AR， 天津市申泰化学试剂有限公司)、Tris碱(Tris base) (AR，美国Genview公司，北京鼎国 分装)、硼酸(boric acid) (AR，天津市化学试剂六厂)、Na2EDTA 2H20 (美国Amresco 公司)、丙烯酰胺(acrylamide) (Ultra Pure 99.9°/。， BBI原装，Canada)、双丙烯酰胺(bis-acrylamide) (Ultra Pure 99.0%， BBI原装，Canada)、尿素(urea) (Ultra Pure 99.5%,美国Amresco公司)、过硫酸铵(ammonium persulfate; APS) (AR，长沙欧麦公 司)、TEMED (tetramethykthylenedia mine;四甲基乙二胺)(AR，上海生工)、甲酰胺(formamide) (HPLC级，上海生工)、溴酚蓝(bromophenol blue ) (AR， Sanland-chem International Inc.)、 二甲苯兰FF (AR， xylene cyanol FF, 美国Sigma公司)3、 溶液配制 10XTBE:Tris碱0.5 mol/L EDTA(pH8.0) ddH20 to 30%丙烯酰胺储存液丙烯酰胺 双丙烯酰胺 ddH20 to G3砂芯漏斗过滤，6%凝胶储存液:10%过硫酸铵Urea 10XTBE30°/。丙烯酰胺储存液 ddH20 to store at4。C.过硫酸铵 ddH20 to108 g 55 g 40 ml 1 000 ml28.5 g 1.5 g 100 ml store at 4 °C63 g 15 ml 30 ml 150 mllg 10 mlstore at4。C. 95%乙醇-0.5°/。冰乙酸95%乙醇 99.5 ml-冰乙酸 0.5 ml 甲酰胺上样缓冲液(98%): 7甲酰胺 98 ml0.5 mol/L EDTA 2 ml溴酚蓝 0.25 g二.甲苯兰FF 0.25 g4、方法步骤(1) 玻璃板准备每次铺胶前均需分别严格处理平玻璃板和凹玻璃板，硅化玻璃板操作过程中应戴手套且在 通风橱中进行。1) 平玻璃板准备按下述程序进行a. 加2 pi亲和硅烷到1 ml 95%乙醇-0.5°/0冰乙酸中。b. 把亲和硅烷溶液滴到平玻璃板上，用擦镜纸轻拭擦匀整块平玻璃板面。c. 4 5min后，加2 ml 95%乙醇到平玻璃板上，用擦镜纸向一个方向轻轻擦拭，然后，垂直 方向略用力擦拭。重复2次，每次均须换用干净的纸，以除去多余的粘合溶液。2) 凹玻璃板准备a. —定要更换手套，防止交叉污染亲和硅烷溶液，否则会导致凝胶撕裂。b. 滴加lml疏水硅垸溶液于凹玻璃板上，擦镜纸轻轻擦匀。c. 5 10min后，加2 m95%乙醇于玻璃板上，先单方向擦拭玻璃板，然后再按与原来垂直 的方向擦拭。重复1次。(2) 凝胶准备1) 制做胶室把平玻璃板水平放置，沿其长缘把0.4 mm厚压片放好，然后，将凹玻璃板 压于其上，用夹子固定于两侧。调整夹子，使鲨鱼齿梳子能方便地插入。水平仪调节水平。2) 制备6%凝胶液取50 ml 6%凝胶储液至干净烧杯中，加热至室温，加入250 10% 过硫酸铵和25 pi TEMED，立即轻轻搅动混匀并避免产生气泡。3) 灌制胶板立刻用50 ml注射器抽取6%凝胶液，使注射器头始终位于液面下，将凝胶 沿着压片边缘缓慢地注射到两玻璃板之间的空隙中，溶液靠毛细作用向胶室底端移动，保 持溶液流连续，避免形成气泡， 一旦形成气泡，用手或注射器柄轻敲玻璃板使气泡移出， 否则会影响电泳结果。将剩下的凝胶溶液于4\'C保存，减缓聚合速度。4) 制作加样槽胶室灌满后，立即插入鲨鱼齿梳子的平缘至胶内5mm左右，小心勿使梳 子下形成气泡，用2个夹子夹住胶室顶端，使玻璃板与压片和梳子贴紧，以防加样时漏样。 插入鲨鱼齿梳子时动作要快，若凝胶开始聚合，则鲨鱼齿梳子将很难插入。检査是否有凝 胶泄漏，若需要可用剩下的凝胶溶液将胶室灌满。5)凝胶聚合静止放置使凝胶聚合，若凝胶有明显回縮，可再添加些凝胶溶液。使用甜， 凝胶至少聚合2h，梳子下出现Schlieren线时，标志聚合反应己经完成。若聚合过夜，用 浸透1 X TBE的滤纸覆盖梳子和玻璃板的底端，以防凝胶变干。 (3)加样及电泳 1) 除去固定玻璃板的夹子，清除梳子周围的聚丙烯酰胺凝胶，用ddH20冲洗板的顶端，洗 净未聚合的丙烯酰胺和滤出的尿素，^小心轻轻地取出鲨鱼齿梳子，不要拉扯凝胶顶部，用 ddH20冲洗加样槽。用水清洗梳子，以供下面使用。2) 将胶板固定在电泳槽中，稀释IOXTBE至1XTBE，约1100ml，加入上下两个电泳槽 中，用吸管吸取1XTBE冲洗加样槽，以去除可能存在的未聚合丙烯酰胺，并避免加样槽 内形成气泡。3) 预电泳接上电源，用60 W恒功率预电泳30min，预电泳时，在加样槽上方用注射器 吸取电泳缓冲液把析出的尿素向两侧吹赶。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使 凝胶板达到所需的温度，可防止GC丰富区形成发夹结构。4) 30min后，切断电源。用1XTBE冲洗加样槽，进一步除去尿素。把鲨鱼齿梳子有齿的 一头插入加样槽至胶内约1 mm，形成加样孔。5) 样品制备预电泳时，即可进行样品的制备。PCR扩增产物甲酰胺上样缓冲液按8: 3(V:V)混合，95。C变性8min，然后立即簟冰浴中冷却。6) 加样立即用移液枪吸取3 5)iU样品，加入样品孔中。加样枪头应在缓冲液槽中冲洗几 次后，再吸另一样品。加样时速度要快，但不要产生气泡，以防吹出样品。加样完毕后， 立即电泳。7) 电泳60W恒功率电泳，观察指示剂的迁移情况，以确定电泳时间，约150min。跑胶 10min后可移去梳子。8) 电泳结束后，排尽缓冲液，卸下胶板，小心分开两块玻璃板，凝胶应牢固地附着在平玻 璃板上，放入银染固定液中固定。(二)、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的银染1、 主要仪器和材料塑料方盘4 6个，约50cmX35cmX8cm大小、脱色摇床(哈尔滨东联电子)2、 主要试剂冰乙酸(glacial acetic acid) (GR,天津市永大化学试剂开发中心)、硝酸银(silver nitrate) (ACS 99.0%， BBI原装，Canada) 、 37°/0甲醛(formaldehyde) (ACS 36%~38%， BBI 原装，Canada)、无7jC碳酸钠(sodium carbonate, anhydrous) (ACS〉99.5%，美国Amresco 公司)、硫代硫酸钠(sodiumthiosulfate) (AR，天津市苏庄化学试剂厂)3、 溶液配制银染固定液(10%冰乙酸)冰乙酸 200 mlddH20 1 800 ml银染染色液(lg/L硝酸银，0.056%甲醛)硝酸银 2 g37%甲醛 3 mlddH20 to 2L 银染显色液(30g/L碳酸钠，0.056%甲醛，2mg/L硫代硫酸钠)无水碳酸钠 60 gddH20 to 2L 冷却至4 10°C。在临用前立即向碳酸钠溶液中加入3 ml 37%甲醛和400 pi 10 mg/ml硫代 硫酸钠溶液，既成显色液。 4、染色程序染色过程要求凝胶浸在塑料盘内的溶液中，因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类 似。在盘中加入新鲜溶液之前必须用高质量的水洗涤盘子。(1) 电泳结束后卸下胶板，用手术刀片小心地分开两块玻璃板，去掉压片，凝胶应该牢固地 附着在平玻璃板上。(2) 固定凝胶将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液2L浸没，充分振荡20min或至 样品中指示剂完全消失。胶亦可在固定溶液中保存过夜(不要振荡)。保留固定溶液，以备用 于终止显色反应。(3) 洗胶用超纯水振荡洗胶3次，每次3min。从水中取出，在进行下一步洗涤之前，拿 着胶板边缘静止10 20s，使水流尽，再进行下一步操作。(4) 凝胶染色往染色盘中倒入2L染色液，把凝胶移至染色溶液中，充分振荡40min。(5) 凝胶显色-1) 显色液的配制在上一步即将结束时，向预冷至4 10°。的碳酸钠溶液中加入37%甲醛3 ml和10mg/ml的硫代硫酸钠溶液400 pl，既成显色液。往显色盘中倒入预冷的显色液1 L， 放在一边，其余显色液仍放在冰浴中。把凝胶从染色液中取出，放在一边，染色液回收到 烧杯中，盘清洗后加入超纯水。2) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5 10 s。注意，把凝胶从超纯水中 转移到显色溶液中时动作要快，总时间不能长于5 10s。浸泡时间过长则导致信号微弱或 丧失信号。若浸泡时间过长，可重复用染色液浸泡染色。3) 立刻将凝胶转移至1L(总量的一半)预冷的显色液中，充分振荡，直至模板条带开始显现 或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2 3min，或直至所有条带出现。(6) 终止显色反应弃掉显色液，加入1L固定溶液，置摇床上反应2 3 min，终止显色反 应，固定凝胶。(7) 洗胶在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2min。注意在本操作中应戴手套拿着胶板边 缘，避免在胶上印上指纹。(8) 干胶将凝胶置于室温干燥，观察并照相、扫描保留实验结果。实施例14AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的歩骤为(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1)向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上 样缓冲溶液的体积比为8 : 3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳20min后，取3pl上 样混合物加样到6%变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳150min，亦即至二甲苯青FF 指示带距凝胶底部2cm时终止电泳； (2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色1) 电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振荡10 min或至指示剂完全消失；2) 用超纯水振荡洗胶4次，每次2 min;3) 把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液为含有1 g/L硝酸银、1.5ml/L37。/。甲醛的水溶液， 充分振荡20 min;4) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5 s，立刻将凝胶转移至l L预冷的 显色液中，显色液为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5 ml/L 37%甲醛的水溶液， 充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1 L预 冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色3min，或直至所有条带出现；5) 待凝胶完全显色后，加入l L固定溶液，振荡3 min，终止显色反应，固定凝胶；6) 在超纯水中浸洗凝胶2次，每次5 min;7) 将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果； 实施例15AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为 (1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1)向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上 样缓冲溶液的体积比为8 : 3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳50min后，取6pl上 样混合物加样到6%变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120min,亦即至二甲苯青FF 指示带距凝胶底部5cm时终止电泳； (2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色1) 电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10%的冰乙酸的水溶液为固定液，充 分振荡30 min或至指示剂完全消失；2) 用超纯水振荡洗胶2次，每次5min;3) 把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液为含有1 g/L硝酸银、1.5 ml/L37。/。甲醛的水溶液， 充分振荡40 min;4) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗10 s，立刻将凝胶转移至1 L预冷的 显色液中，显色液为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5 ml/L 37°/。甲醛的水溶液， 充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的l L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2min，或直至所有条带出现5) 待凝胶完全显色后，加入l L固定溶液，振荡2 min,终止显色反应，固定凝胶；6) 在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2min;7) 将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果； 实施例16差异片段的回收、扩增、克隆、.测序及同源相似性检索分析步骤为(1) 差异片段DNA的回收用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水 35^11，置沸水浴中15 min，然后5000 r/min离心7 min，收集上清液备用；(2) 回收差异片段DNA的PCR再扩增PCR再扩增的反应体系总体积为50 nl，其中包括差异片段DNA的回收上清液7 pl， Taq I选择性扩增引物lOpmol， Pst I选择性扩增引物lOpmol， 1 XTaq PCR MasterMix，其 中lXTaq PCRMasterMix的成分终浓度为10 mmol/LTris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCI， 1.5 mmol/LMgCl2， 250 pmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进行PCR 扩增反应94°C 0.5min， 56°C lmin， 72°C 0.5min， 25个循环后，72°C 15 min，经1.5% 琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，8\'C保存；(3) 克隆回收差异片段DNAPCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连 接有回收差异片段DNAPCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞， 使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体 积为20(il，其中包括T载体质粒重组子6pl， SalI10u， Xba I 10u， 1Xbuffer，混匀后，37 。C 3h， 70°C 5min;T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，可见 2 681 bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段 DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；(4) 同源相似性检索分析将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库 中进行同源相似性检索分析。 实施例17片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为(1) 差异片段DNA的回收用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水 40 |il，置沸水浴中20 min，然后8 000 r/min离心10 min，收集上清液备用；(2) 回收差异片段DNA的PCR再扩增 PCR再扩增的反应体系总体积为50pl，其中包括差昇片段DNA的回收上清液7m1，Taq I选择性扩增引物lOpmol， Pst I选择性扩增引物lOpmol， 1 XTaq PCRMasterMix ，其中1XTaqPCRMasterMix的成分终浓度为:10 mmol/LTris-HCl pH8.3， 50mmol/LKCI， 1.5 mmol/LMgCl2， 250 |jmol/L dNTP each, 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进行PCR 扩增反应94°C 2min， 65°C 0.5min， 72。C2min， 40个循环后，72°C 5 min，经1.5%琼 脂糖凝胶电泳证实有PGR产物，4\'C保存；(3) 克隆回收差异片段DNAPCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连 接有回收差异片段DNAPCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞， 使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体 积为20^i，其中包括T载体质粒重组子6jul， SalI10u， Xba I 10u， 1Xbuffer，混匀后，37 °C lh， 70°C 15min;T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，可见2 681 bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段DNA-T载 体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；(4) 同源相似性检索分析将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库 中进行同源相似性检索分析。 实施例18差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为 (一)、差异片段的回收和扩增1、 主要仪器和材料 PCR仪(同前) 电泳仪(同前)2、 主要试剂Taq PCR MasterMix (同前) PCR扩增引物(同前)3、 方法(1) 差异片段DNA的回收1) 仔细观察银染后的聚丙烯酰胺凝胶上免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸 磁颗粒非特异吸附组、空白对照组各泳道上的条带分布，找出免疫磁性特异分离组与免疫 磁性非特异吸附组和裸磁颗粒非特异吸附组之间的差异条带。2) 用锋利的手术刀片直接从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管 中。3) 向管中加入超纯水30pl，置沸水浴中10min。 .4) 3 000 r/min离心5 min,收集上清液备用。(2) 回收差异片段DNA的PCR再扩增由于PAGE的样品上样量较少，从片段中回收的差异片段DNA的量亦较少，故需对回收产物进行PCR再扩增，所用引物与该产物AFLP-PCR选择性扩增的引物相同, PCR再扩增的反应体系回收产物上清液 Taql选择性扩增引物 Pstl选择性扩增引物 Taq PCR MasterMix H20Total7^1 2^1 2 nl 25 pi 14 pi 50 piPCR再扩增的反应条件:1)94 °C2 min2)94 °C30 s3)60 °C30 s4)72 。C]min5)Go to 2)，repeat 39 cycles6)72 °C10 min7)4°CholdPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察是否有回收产物。见图10和图11，图10中，M: DNA Marker DL2000;其余泳道为不同差异条带的回收再扩增产物。 图11中，中间为DNA Marker DL2000;其余泳道为不同差异条带的回收再扩增产物。 (二)、差异片段的克隆和测序1、 主要仪器 紫外分析仪(同前)电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司) 台式高速冷冻离心机(同前)2、 主要试剂回收DNA片段PCR再扩增产物TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (大连宝生物公司) T载体质粒pMD18-T vector (大连宝生物公司)X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- P -D-Galactoside)(大连宝生物公司) IPTG(Isopropyl- P -D-thiogalactopyranoside)(大连宝生物公司) ￡ co// competent cell DH5 a (大连宝生物公司) 质粒提取试剂盒(美国Promega公司)3、 主要试剂的配制(1) LB培养基(pH-7.2):胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g，加超纯水至1 000 ml， 加碳酸钠调pH至7.2，高压消毒后备用。(2) 5XX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚—e-半乳糖苷):溶解25 mg的X-gal于1 ml的二甲基甲酰胺(DMF)，用铝箔包裹装液管，-2(TC冻存备用。(3)氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml):溶解lg氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定 容至10 ml。分装后于-20\'C贮存。以25 50^g/ml的终浓度添加于生长培养基。 4、方法 .(1)回收DNA片段PCR再扩增产物的回收和纯化 1 )用1 XTBE缓冲液配制1.5%的琼骋糖凝胶，然后对目的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳， 约35 min。2) 在紫外分析仪中观察凝胶中DNA条带的位置，与预计大小相符时，用锋利刀片切下含 有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液，并尽量切除多余的凝 胶，减小凝胶体积，提高DNA的回收率。3) 称量凝胶块的重量，根据lmg^W计算凝胶块的体积。4) 切碎胶块，可縮短回收时间，提高DNA回收率。5) 向胶块中加入胶块溶合融化液DR-I buffer,加入DR-I buffer的量是凝胶块体积的4 倍。6) 混合均匀后，置75\"C水浴中加热融化胶块，约10 min，此间应间断振荡混合，使胶块 充分融化。否则，会严重影响DNA的回收率。7) 向上述胶块融化液中加入DR-I buffer 1/2体积量的DR-I1 buffer,混合均匀。当回 收片段小于400 bp时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8) 将Spin Column柱装入Collection管中。9) 将步骤7)中的溶液转移到Spin Column柱中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。如将 滤液再加入到Spin Column柱中离心一次，可提高DNA的回收率。10) 将500(^1的Rinase A加入到Spin Column柱中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。11) 将700 |al的RinaseB加入到Spin Column柱中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。12) 重复步骤11)。13) 将Spin Column柱安装到新的1.5 ml离心管中，向Spin Column柱膜的中央处滴加预热 到60\'C的灭菌超纯水25 |al，室温静置1 min。14) 12 000 r/min离心1 min洗脱DNA，收集洗脱液(含有差异片段DNA)分装冻存备用。 (2)差异片段的克隆和测序1) T载体简介pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA cloning)的专用载体，由pUC18载体 改建而成，在pUC18、 pUC19载体的多克隆位点处导入了 EcoRV识别位点，使用EcoRV 进行酶切反应后，再在两侧的3\'端添加\"T\"而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR 反应时都有在PCR产物的3\'末端添加一个\"A\"的特性，所以使用这种载体可以进行PCR 产物的连接和克隆。2) T-A连接与克隆 ①T-A连接连接反应体系在冰水浴中向200 pi PCR管中加入以下成份并混匀，以H20代替纯 化的PCR产物进行连接反应为阴性对照。pMD18-T Vector(50 ng/^il) 1 ^il差异片段DNA回收洗脱液 1 nl连接液Solution I 5 |ilH20 3 piTotal 1(M 连接反应条件16°C 30min， .2(TC保存备用。② 用T-A连接产物转化大肠杆菌DH5 ct感受态细菌a. 用冷却的无菌吸头取200 pi感受态细胞悬液，转移到无菌1.5ml离心管中，再加 入T-A连接产物或阴性对照组的连接产物10 jal，轻轻旋转混匀，在冰水浴中放置 30 min。b. 将离心管放到42\'C水浴中，热冲击lmin，不要摇动离心管。c. 快速将离心管转移到冰水浴中，使细胞冷却2 min。d. 每管加800 ^1LB培养基，37\'C轻摇(转速不超过225 r/min) 1 h;以使细胞复苏 并增加感受效率。e. 取lOOpl转化液涂抹含有X-Gal、 IPTG和Amp的L-琼脂平板培养基，置于37 \'C至液体被吸收后倒置平板，于37\'C培养，12-16 h后可出现菌落。pMD18-T Vector 和差异DNA片段结合成阳性重组子，其菌落为白色，pMD18-T Vector自身环化成 阴性重组子，其菌落为蓝色。③ T-A克隆的扩增与提取a. 从平板上挑一个白色或蓝色单菌落，加入含Amp的LB培养基中，37。C振摇培养过 夜，直至菌液明显混浊。b. 吸取菌液5ml于EP管中，室温，10 000Xg离心1 min。c. 弃上清，将细菌沉淀以250 ^ Solution I(含RNAase)重悬，吹打并剧烈振荡以混匀 细菌。d. 温和加入Solution II 250^1，轻柔颠倒混合数次，室温放置5 min,可见菌液完全清 亮。e. 温和加入Solution III 350 pl，轻柔颠倒混合至见白色絮状沉淀；室温12 000Xg离 心10 min。f. 将上清小心转移至吸附柱中(勿吸白色沉淀)，然后将吸附柱置入试剂盒所配的2 ml EP管中，室温10 000Xg离心1 min。g. 弃滤液，在吸附柱中加入500 pi Buffer HB，室温10000Xg离心1 min。h. 弃滤液，向吸附柱中加750 nl wash buffer,室温10 000Xg离心1 min，使溶液过 柱。重复此步骤一次。i. 室温10 000Xg离心2min，彻底除去washbuffer。 j.把吸附柱放入无菌的1.5mlEP管中，加无菌水30pl于吸附柱中。 k.室温10 000Xg离心1 min，此时滤液中含有T-A连接所形成的质粒。 ④T-A克隆的酶切鉴定pMD18-T Vector的T克隆位点位于Xba I和Sal I两个酶切位点之间，二者之间 为11 bp，用这两种酶进行双酶切时，产生2 681 bp和11 bp两个片段，在1.5%的琼 脂糖凝胶电泳时，由于11 bp的片段太小，只能看到2 681 bp的条带，如将DNA片 段成功插入T克隆位点后再进行双酶切，电泳时则可见2 681 bp和11+差异片段长度 bp的两个片段。见图12，图中M: 100 bp DNA Ladder Marker; 1:阳性重组质粒；2:阴性重组质粒 酶切反应体系10 x buffer 2 pi重组质粒 6 )JSal I 1Xba I 1 ^ddH20 10 piTotal 20 )il酶切反应条件37°C 2h。. 然后经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。将获得的差异片段DNA-T载体阳性重组子送交北 京Imdtrogen公司进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列。共获得125条差异片段DNA的核苷酸序列，将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美 国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)中的全基 因组核酸数据库中进行BLAST(basic local alignment search tool,基本局部相似性査询工具) 相似性检索分析，与数据库中所有已知序列相比，寻找与待查序列有足够相似性的序列， 以提供功能相似的估计，或者确定该序列在基因组中是一个新的序列。把新的未知核苷酸 序列向GenBank申请提交注册。 现举例说明. 如25-1序列tcctatatag ctactgcctg tctctcacct cctcaatgct aatcatgctc aggtcttcca 60 ggccattagt gctgaaatag ggctgccaag ggttaatgag tcctggctcc ctctgttctc 120 atctctttag agggacaagc tggccctagg ctctatctag cctgtgggac aggtaaccaa 180 ggagcacggg tgagagttgc agaacccaag tcaaagacta cagggatggg tcctctcatc 240 tttactcaga gggaacctgt agtatagatg ctgtctgttc aggagcaccg ttcgctcagg 300 actcatca 308经BLAST相似性检索分析后，其对应的基因是已知基因Ngfb (nerve growth factor, beta [Mus musculus ], GeneID: 18049沐1 Tspan2 (tetraspanin 2 [ Mus musculus ]， GeneID: 70747)。 如25-3序列ccagcactgg gtgctctgtg aatacttaaa agattccagc ccgtcttttc ctgcttctct 60 ctgggtgatt cttattttta tctcctccac aacttcctac ttaattttaa ctttccgttc 120 cctcctggct ggtttatatt ccaggaggct ctatgctatt cagttcctta tgactccttc 180 taacagcgtt cgctcaggac. tcatca 206经BLAST相似性检索分析后，其对应的基因是未知功能的已知基因2410003LllRikRIKEN cDNA2410003L11 gene [ Mus musculus ]， .GenelD: 69729。 如38-3序列gacggccgtc atgcagactc aatgcaatcc ccattaaaat tccaactcaa ttattcaacg 60 aattagaagg agcaatttgc aaattcatct ggaataacaa aaaaccgagg atagcaaaaa 120 ctcttctcaa gggtaaaaga acctctggtg gaatcaccat gccagaccta aagctttatt 180 acagagcaat tgtgataaaa actgcatggt actggtatag agacagacaa gtggaccaat 240 ggaatagaat tgaagaccca ggaatgaacc cacacaccta tggtcgcttg atcttcgctc 300 aggactcatc 310经BLAST相似性检索分析后，该序列为与已知基因没有同源相似性的核苷酸序列， 已向GenBank提交注册为新序列，该序列在GenBank的基因登录号为EF473141 。 实施例19研究结果1、 以扩增片段长度多态性(AFLP)和免疫磁性分离(IMS)相结合，成功建立了基于小鼠 全基因组的高效、特异筛选BPDE致癌相关基因的方法。2、 成功获得了清晰的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带图谱和与BPDE作用的差异DNA 片段条带图谱，并成功对差异片段进行了回收、扩增、克隆测序，共获得125条差异片段 DNA的核苷酸序列。3、 经BLAST分析发现有193条已知基因与差异片段核苷酸序列有同源性，主要为 信号转导及通路、生长发育、血管生成、免疫及炎性反应、转录调控、细胞分化等方面的 基因和一些未知功能的基因。有6条未知核苷酸序列，向GenBank提交注册，已被GenBank 接受为新序列并给予相应的基因登录号分别为EF176681、 EF473140、 EF473141 、 EF473142、 EF473143、 EF473144。这些基因和序列有可能是与BPDE致癌相关的基因序列。研究结论1、 扩增片段长度多态性(AFLP)和免疫磁性分离(IMS)技术相结合的方法，适用于在小 鼠全基因组筛选BPDE致癌相关基因。2、 AFLP与IMS技术相结合，共获得125条差异片段DNA的核苷酸序列。经BLAST 分析发现有193条己知基因与差异片段核苷酸序列有同源性，有6条未知核苷酸序列， 这些基因和序列有可能是与BPDE致癌相关的基因和序列。权利要求1.BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；(2)AFLP DNA片段的制备基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离AFLP DNA片段与BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分离出来；(4)AFLP PCR扩增AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。2. 根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述AFLP DNA片段的制备为(1) 用T叫I消化准备4-6个反应体系，每个反应体系总体积为20 pl，其中包括DNA 300 ng， T叫I 10u， 1Xbuffer，其中lXbuffer的成分终浓度为50 mM Tris-HCl pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50 mM NaCl，混匀后，65\'C恒温水浴消化1 3 h;(2) 向每一反应体系中补加Pst I 10u， 3广C恒温水浴消化l 3h后，70 75。C水浴10 20 min灭活酶的活性，4 8。C保存备用；(3) 1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。3. 根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述与 BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断1) 取所述AFLP DNA片段20 pl，分成4组放入试管中免疫磁性特异分离组、免疫磁性 非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；2) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2 mmol/L的BPDE 0. 5 2 pl，其余各组分 别加入0.5 2 pl灭菌超纯水，37\'C避光孵育3 7 d;3) 向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10 : 4的乙酸乙酯和乙醚20 22 pl， 轻摇混匀，静置l 4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复2 4次，纯化、沉淀 DNA-BPDE加合物，加20 pl水重悬DNA-BPDE加合物；4) 向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米 磁性颗粒0.5 2nl，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒0. 5 2 nl，向所述 正常对照组中加入灭菌超纯水0. 5 2 pl，室温、避光、轻摇10 30 niin;5) 把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2 5 min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃 上清液，用灭菌超纯水30 40 pl洗2 4次，每次2 5 min;6) 加5 pl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液； (2) AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离把歩骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合 物溶液的试管放入沸水浴中10 15 min，然后8000 11 000 r/min离心5 10 min，收 集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用 的AFLP DNA片段，-2CTC冻存备用。4. 根据权利要求3所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述针 对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为(1) 取裸纳米磁颗粒330 pi,加入一干净灭菌的1.5 ml离心管中；(2) 在磁场作用2 5 min，吸弃上清；(3) 取0. 1 raol/L pH7. 8磷酸缓冲液330 pl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体 500(4) 20 25。C孵育10 20 min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为lmg/ml;(5) 在避光条件下，4 8\'C孵育10 16 h，不时轻轻颠倒；(6) 把离心管放入磁分离架作用2 5 min，吸弃上清；(7) 向管中加330 pl pH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20 25匸孵育 5 10 min，轻轻颠倒；(8) 重复步骤(6)、 (7)各2次；(9) 把离心管放入磁分离架作用2 5 min，吸弃上清；(10) 从分离架上取出离心管，加入330 pl pH 7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒一抗体 耦合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒。5. 根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述AFLP PCR扩增的步骤为(1) AFLP-DNA片段与接头的连接连接反应体系总体积为20 其中包括AFLP-DNA片段5 pl， Taq I接头5 pmol， Pst I接头2 pmol， T4 DNA ligase 400u， IXbuffer,其中IXbuffer的成分终浓度为 50mM Tris-HCl， 10mM MgCl2， 10mM DTT， ImM ATP， 25pg/ml BSA， pH 7.5;连接反应条件 为16 25°C 1 4 h， 70°C 5 15 min， 4 8。C保存；所述 Taql接头为5\' -GACGATGAGTCCTGA G -3\' 3\' -TACTCAGGACT CGC-5\' Pstl接头为5\' -GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3\' 3\' -GCACTGCCGGCAG T —5\'(2) AFLP预扩增PCR:AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20 pl，其中包括从所述歩骤(1)获得的连接 产物1 pl， Taq I预扩增引物5 pmol， Pst I预扩增引物5 pmol， IXTaq PCR MasterMix，其中lXTaq PCRMasterMix的成分终浓度为10匪ol/L Tris-HCl pH8. 3， 5O國ol/LKC1， 1.5 mmol/L MgCL， 250 )amol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件 进行PCR扩增反应94°C 0. 5 lmin， 56°C 0. 5 2min， 72°C 0. 5 2min， 20 40个 循环后，72°C 5 15 min， AFLP预扩增PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带 出现后，稀释20 50倍，4 8\'C保存备用；所述Taq I预扩增引物为 5\' -GATGAGTCCTGAG CGA A-3\' Pst I预扩增引物为 5\' -GACGGCCGTCA TGCAG A-3\' (3) AFLP选择性扩增PCRAFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20 )til，其中包括AFLP预扩增PCR产物稀 释液l)nl， Taql选择性扩增引物5 pmol， Pst I选择性扩增引物5 pmol， lXTaq PCR MasterMix，其中lXTaq PCR MasterMix的成分终浓度为:10 mmol/L Tris-HC1 pH8. 3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混匀 后，按下述条件进行PCR扩增反应94°C 0. 5 lmin， 65°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min，其中退火温度从65\'C开始每循环降低0.7t:，共12个循环，12个循环后反应条件 变为94。C 0. 5 lmin， 56°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min ， 20 30个循环后，72°C 5 15 min， AFLP选择性扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4 8\'C保存， 然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引 物为4条，Pst I选择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合。6.根据权利要求5所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述4 条Taq I选择性扩增引物分别为Taql选择性扩增引物l 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAACG-3\' Taq I选择性扩增引物2 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAATG-3\' Taql选择性扩增引物3 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3\' Taql选择性扩增引物4 5\' -GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3\' 所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为Pstl选择性扩增引物l 5\' -GACGGCCGTCATGCAGAGC-3\'Pst I选择性扩增引物2 5\' -GACGGCCGTCATGCAGATG-3\'Pst I选择性扩增引物3 5\' -GACGGCCGTCATGCAGACT-3\' Pstl选择性扩增引物4 5\' -GACGGCCGTCATGCAGAAC-3\'Pst I选择性扩增引物55\' -GACGGCCGTCATGCAGATT-3\' 所述20对引物组合分为12345678910P1T1P1T2P1T3P1T4P2T1P2T2P2T3P2T4P3T1P3T211121314151617181920P3T3P3T4P4T1P4T2P4T3P4T4P5T1P5T2P5T3P5T47.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的歩骤为(1) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与 上样缓冲溶液的体积比为8 : 3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳20 50min后，取3 6^1上样混合物加样到6%变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120 150min，亦即至 二甲苯青FF指示带距凝胶底部2 5cm时终止电泳；(2) 变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色1) 电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10%的冰乙酸水溶液即固定液中固定， 充分振荡10 30 min或至指示剂完全消失；2) 用超纯水振荡洗胶2 4次，每次2 5 min;3) 把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液的成分为含有l g/L硝酸银、1.5 ml/L 37%甲醛 的水溶液，充分振荡20 40 min;4) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5 10 s，立刻将凝胶转移至l L预 冷的显色液中，显色液的成分为含有30 g/L碳酸钠、2 mg/L硫代硫酸钠、1.5 ml/L 37% 甲醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液， 把新鲜的l L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2 3 min，或直至所有条带出现；5) 待凝胶完全显色后，加入1 L固定溶液，振荡2 3 min，终止显色反应，固定凝胶；6) 在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2 5 min;7) 将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果。8.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述差 异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为(1) 差异片段DNA的回收用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水 30 40 ial，置沸水浴中10 20 min，然后3 000 8 000 r/min离心5 10 min，收集上 清液备用；(2) 回收差异片段DNA的PCR再扩增 PCR再扩增的反应体系总体积为50pl，其中包括差异片段DNA的回收上清液7pl，Taq I选择性扩增引物10 pmol， Pst I选择性扩增引物10 pmol, lXTaq PCR MasterMix， 其中1 XTaq PCR MasterMix的成分终浓度为10 mmol/L Tris-HC1 pH8. 3， 50 mmol/L KC1， 1.5 mmol/L MgCl2， 250 pmol/L dNTP each， 2u Taq polymerase,混匀后，按下述条件进 行PCR扩增反应94°C 0. 5 2min， 56 65°C 0. 5 lmin， 72°C 0. 5 2min， 25 40个 循环后，72°C 5 15 min，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，4 8。C保存；(3) 克隆回收差异片段DNA PCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连接 有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，使T 载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体积为 20|_d，其中包括T载体质粒重组子6nl， Sal I 10u， Xba I 10u， lXbuffer，混匀后，37 °C 1 3 h， 70°C 5 15 min:T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，可 见2 681 bp和ll+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段 DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列； (4)同源相似性检索分析将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库中 进行同源相似性检索分析。全文摘要本发明公开了一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；(2)AFLP DNA片段的制备；(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离；(4)AFLP PCR扩增；(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析，本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，为一高效、特异的方法，在全基因组水平筛选出更多的BPDE致癌易感基因，为阐明BPDE的致癌分子机制打下基础。文档编号C12Q1/68GK101113474SQ20071005841公开日2008年1月30日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日发明者李君文, 王新为, 王景峰, 谌志强, 邱志刚, 敏 金, 陈照立 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所