核酶实验 - 实验方法

来自 : 发布时间：2024-05-04

核酶（ribozyme)是一类具有酶特性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。核酶广泛存在于从低等到高等的多种生物中，参细胞内RNA及其前体的加工和成熟过程。本实验来源「RNA实验指导手册」主编：郑晓飞。 0 收藏 0 阅读 锤头型核酶是最简单的一类核酶，而且其靶序列也比较简单。锤头型核酶发现于几种植物病毒的卫星 RNA、一种类病毒 RNA 和蝾螈核卫星 DNA 的转录产物中。它催化一些类病毒 RNA 和一些与类病毒 RNA 相似的只复制产物的不可逆自我剪切„ 一、材料与设备所有试剂及容器需绐去 RNase 处理。1. 主要设备：低温高速离心机、聚丙烯酰胺电泳装置、放射自显影用具、水浴等。2. CMCT，I-cyclohexyI-( 2-morphohnoethyI) carbodiimide metho-p-tohicne sulfon- ate ( Sigma，St. Louis，MO )。3. 缓冲液 A：14 mmol/L Tris-HCl (pH 7.3)，70 mmol/L KCl，0.14 mmol/L EDTA。4. 缓冲液 B：6.25 mmol/L dNTPs、250 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，15 mmol/L DTT。5. 甲酰胺上样缓冲液：98% 去离子甲酰胺，0.025% 溴酚蓝，10 mmol/L EDTA。6. 终止缓冲液：90% 去离子甲酰胺，0.025% 溴酚蓝，5 mmol/L EDTA。7. 400 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 。8. [ γ-32P] ATP。9. T4 多核苷酸激酶。10. 10 mol/L NH4Ac。11. RNasin。12. 0.1 mol/L DTT。13. 200 mmoI/L MgCl2。 二、操作方法1. 锤头型核酶的设计及其靶位点的选择(1) 核酶催化核心的设计。最常用的锤头型核酶的催化核心如图所示。研究发现，N2 替换为嘧啶核苷酸类似物可以提高核酶的剪切效率；最近还发现，在保守的 A9 与 G10.1 之间加入一个额外的碱基U10 以后，不仅可以保留活性，使剪切效率提高 3~4 倍，并且不影响 Km 值。另有一种微型核酶，它的结构与锤头型核酶相似，其茎-II 部分被仅含一个单 G-C 碱基对的接头所取代。这种微型核酶的活性依赖于接头的组成，因此通过合理选择接头就可获得低 Mg2+ 浓度条件下仍具有高度活性的微型核酶，而且它能比全长锤头型核酶更有效地对长链 mRNA 进行剪切。由于生理条件下的 Mg2+ 浓度通常比一般核酶反应的 Mg2+ 浓度要低，因而微型核酶在细胞内具有更大的应用价值(2) 核酶结合酶的设计。核酶结合臂的长度及其碱基组成对核酶活性有重要影响。由于核酶需循环使用，因此核酶与特异性位点的高效结合以及从底物 RNA 中快速有效地脱离都是非常重要的。这就要求结合臂的长度必须在保证对底物的特异性(或稳定性) 和允许产物有效解离两个方面取得最佳平衡。对于人类基因组而言，要特异性识别一个基因的最小 ODN 长度在 12~15 bp 之间，故在保证结合特异性的基础上应选择长度最小的序列。也有学者提出，不等长的结合臂比等长的结合臂更有效率。(3) 目标剪切位点的选择。野生型靶位点：当以核酶作为研究基因功能的工具时，我 们可以选择靶 mRNA 上的最佳切割位点，因此，潜在的靶位点应选择 GUCUU 或 GUCUA，在体外证实，其切割效率比仅是 UH 的位点更高。突变位点的选择：当基因突变产生新的 UH 位点时，可以比较成功地把锤头型核酶设计为特异识别突变 mRNA 的形式，因为该突变位点通常位于 mRNA 的可接近区域；若突变并未产生剪切位点但点突变位于周围仅 4 个核苷酸的范围内时，也可以通过改变结合臂的长度和序列来设计特异识別突变位点的锤头型核酶。2. 确定核酶与靶位点的可接近性选择了靶位点以后，最重要的方面是确定该位点的可接近性。因为体内 RNA 转录产物都具有复杂的二级和三级结构，所以必须选择位于 RNA 中可接近区域的靶序列而不能在稳定的高级结构内寻找靶序列。(1) 对靶 mRNA 二级结构的预测利用在线的二级结构预测工具 Mfold (http://bioinfo. math. rpi. edu/~Mfold/rna/forml.dgi) 对以靶序列的 13 个碱基为中心的 200~400 个碱基组成的 RNA 进行结构预测。根据预测结果排除位于稳定茎环结构中的靶位点序列，但若靶位点位于茎结构的末 端，以及部分或全部靶位点序列位于环结构中则是可以接受的。(2) 用 CMCT 作为探针直接检测靶 RNA 的二级结构体外转录的 RNA 的 CMCT 修饰：①反应液组成如表。管 1 作为反转录对照，置于冰浴中；管 2 作为 CMCT 修饰对照；管3作为 CMCT 反应管。②加入 RNA，管 1、2 在 75℃  放置 2 min后，室温放置 5 min。③加入 MgCI2，室温放置 5 min，以使 RNA 二级结构形成，然后再冰浴 5 min。④ 在管 3 中加入 CMCT 起始修饰，并冰浴 2 min。⑤乙醇沉淀。加入 2 μl 5 moI/L NH4Ac，1 μl 1 μg/μl tRNA，60 μl 无水乙醇，-70℃ 放置  10 min，然后以最大转数离心 10 min，去上清，室温放置以使乙醇挥发，置于冰浴中。CMCT 修饰 RNA 的反转录。① 在各管中加入含 103~105 cpm 的 32P 标记末端的反义寡聚核甘酸 (0.2 pmol) 的缓冲液 A，80°C 孵育 2 min，室温放置 10 min。② 加入 16.5 μl 缓冲液 B 和 0.5 μl (100 U) M-MLV 反转录酶（invitrogen)，50°C 孵育 20 min。③乙醇沉淀。加入 5 μl 15 ml/L NH4Ac，90 μl 无水乙醇，-70℃ 放置 10 min，以最大转数离心 10 min，去上清，室温放置以使乙醇挥发，用 10 μl 甲酰胺上样缓冲液溶解，90℃ 放置 3 min 后置于冰浴中。④ 取 4 μl 在10% PAGE-8 mol/L 尿素中电泳，并设立相同反义寡聚核酸的测序反应作为分子质量对照。放射自显影后，根据测序反应的电泳图谱来确定反转录得到的 cDNA 的大小从而确定 CMCT 修饰的位点。3. 锤头型核酶的体外切割在检测了选择的靶位点序列的可接近性以后，必须首先确定所设计的核酶在体外对其靶位点的剪切效率，从而在体内应用前排除那些无效的核酶。(1) 核酶 RNA (一般为 34 个碱基）和底物 RNA (一般为 13 个碱基）可以直接化学合成，也可以用体外转录的方法获得。(2) 底物 RNA 的末端标记（以 TaKaRa 的 T4 多聚核苷酸激酶为例）。① 10 μl 反应体系包括 10 pmol 脱保护的含成 RNA 或转录产物，2 μl 5X Exchange Buffer(公司试剂盒提供），1.5 μl [ y 32P ] ATP( 约 15 μGi )，1 μl T4 激酶。② 37℃ 反应 30 min。③ 70℃ 加热 10 min，以使 T4 激酶失活。④ 乙醇沉淀，加入 2.5 μl 10 mol/L NH4Ac，25 μl 无水乙醇， -20℃ 过夜，14000 r/min，4℃ 离心 30 min，并用 70% 乙醇洗一次，室温放置以使乙醇挥发，最后用 DEPC 水溶解。(3) 剪切反应的时间进程。分析每个核酶的剪切时间进程，以便确定底物被核酶剪切 15% 时的时间点。该时间点常用来进行进一步多轮剪切反成动力学的分析，当 15% 的底物被剪切时，该反应仍属于线性范围，且仍满足用 Michaelis-Memen 方程式所确定的核酶催化性质。若用核酶作为基因治疗的手段时，除了需要检测该核酶对突变位点的剪切能力以外，还必须检测对野生型位点的剪切效率。① 时间进程反应。总体系是 130 μl。② 在 1.5 ml 离心管中混合 400 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 μl 核酶 (2 pmol，终浓度 15 nmol/L)，88 μl 水，65℃ 孵育 2 min 使 RNA 变性，室温 10 min。③ 加入 13 μl RNasin：0.1 mol/L DTT (1 : 10) 混合物， 13 μl 200 mmol/L MgCl2 ( 终浓度 20 mmol/L)，37℃ 孵育 10 min。④ 加入 2 μl 底物 RNA 启动剪切反应， [ 1 μl 32P 标记的底物和未标记的底物（20 pmol ) ] ( 终浓度为 150 nmol/L)。⑤ 在 37℃ 孵育，取时间点为 0 min，2 min，5 min，10 min，15 min，30 min，60 min，120 min，180 min，在每个时间点取出 10 μl 反应液用 10 μl 终止缓冲液终止反应，并置于冰浴中。⑥ 90℃ 3 min 使样品变性，置于冰浴中，取其中 6 μl 在 10% PAGE-8 mol/L 尿素系统中进行变性胶电泳。⑦ 放射自显影。(4) 物种特异性的检测。核酶用于基因治疗时必须要确定核酶的物种特异性，即它仅特异地识別突变的 mRNA 的特性，这种特性使异常的基因表达得到抑制。用 APQ ( allelic preference quotient ) ( 等于突变靶位点剪切率的测定值与野生型靶位点剪切率的测定值之比）来衡量特异性，剪切率从时间进程反应曲线中的线性区段中确定。当 APQ 小于 1 时表明野生型靶位点更容易被剪切，而APQ 大于 1 时则表明突变的靶位点更容易被切割。(5) 竞争剪切时间进程分析。为了进一步分析核酶是否能区分出突变型靶位点和野生型靶位点，可以进行竞争分析，试验方法同上，仅两种底物的比例为 1：1。(6) 多轮剪切反应动力学分析。为了获得核酶催化反应的动力学参数（kcat，Km，Vmax）需要进行多轮剪切反应动力学分析，体内核酶可被检测出的最小 kcat 值是 0.1 min-1 (37℃，20 mmol/L MgCl2 )。每个多轮剪切反应最少要进行三次，核酶浓度为 15 nmol/L， 底物浓度为 150~1500 nmol/L。为使核酶饱和，可能需要较高的底物浓度，但对大多数核酶来说，较低的底物起始浓度即已足够。至少需要三个浓度的底物来分析多轮剪切反应， 以获得准标曲线。① 不同浓度的底物组成。30 nmol/μl 的底物：120 μl 无 RNase 的水，15 μl 300 nmol/μl 未标记底物，15 μl 标记的底物；3 nmol/μl 的底物：135 μl 无 RNase 的水，15 μl 30 nmol/μl 的底物；0.3 nmol/μl 的底物：99 μl 无 RNase 的水，1 μl 30 nmol/μl 的底物。各浓度的底物在加入反应体系中之前需在 37℃ 预热至少 5 min。② 核酶加入以后，在 65℃ 放置 2 min，之后在 25℃ 放置 10 min。③ 加入 MgCl2 以后，37°C 孵育 10 min。④ 加入预热的底物以后， 剪切反应开始，剪切时间通过上述的时间进程分析来确定。⑤ 加入 20 μl 终止缓冲液，终止反应。⑥ 90℃ 3 min，使样品变性，置于冰浴中，取其中 6 μl，进行 10% PAGE-8 mol/L 尿素胶电泳。⑦放射自显影。⑧以产物生成速率的倒数为纵坐标，底物浓度的倒数为横坐标，作出标准曲线，计算各动力学参数。(7) 体外转录 RNA 的剪切时间进程分析。为了更真实地反映体内核酶的作用，首先通过体外转求出含有靶序列的较长的具有更复杂结构的 RNA，从而分析该核酶识別和剪切全长 mRNA 的能力。一般来说，可以构建靶 RNA 的全长 cDNA，或者以剪切位点为中心的至少 200 bp 的 cDNA，并以其为模板体外转录出 RNA。所选择的 RNA 的剪切产物应易于与原底物在 PAGE 胶上分开。将这种 RNA 的剪切时间进程分析力案与第 (5) 步竞争剪切时间进程分析比较。仅有两点不同：首先，核酶与靶 RNA 的比例应该提高到 1：1~10：1；其次，由于这种长转录物与核酶的结合与解离的速度更慢，故选择的时间点应为 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、24 h。(8) 利用细胞提取物，直接分析核酶对天然 RNA 的剪切效率。4. 核酶在细胞内的应用将获得的剪切效率最高的核酶基因序列构建入载体，导入细胞，分析目的基因的表达。(1) 表达载体的构建策略。核酶的表达可以利用 Pol Ⅱ 和 Pol Ⅲ 启动子。Pol Ⅱ 启动子的优势在于，由它起始转录的 RNA 具有 5\' 帽和 3\'-poly (A) 尾，因而稳定且定位在细胞质中，还具有组织特异性；而 Pol Ⅱ 潜在的不利之处是原初转录物需要加工后才能保证转运出核。可取代的方案是利用 U1 RNA启动子，将核酶基因序列插入 U1 RNA 的编码序列中或取代 U1 RNA 位于启动子和转录终止信号之间的部分，这个方案的最大优点是产生的转录产物可与特异的 U1 蛋白结合而大大增加其稳定性。Pol Ⅲ 启动子一般启动短的有高度结构的RNA，例如 tRNA，U6 snRNA，腺病毒 VA1 RNA，7SL RNA，Y RNA，5S rRMA，转录一般在 4~6 个连续的 U 处终止。核酶研究中已经利用的有腺病毒 VA1 RNA、tKNA、U6 snRNA 启动子构建的表达载体。(2) 核酶与靶 RNA 的共定位。细胞内核酶效率的决定性因素是核酶与靶 RNA 的共定位。因为特异的靶 RNA 可以定位在细胞中的不同部位（例如细胞核，核仁，细胞质）， 所以应该保证核酶能够在靶 RNA 定位的相同的细胞内区域高表达。(3) 核酶的导入，内源基因方式。可以用病毒载体或非病毒载体，例如可以利用重组腺相关病毒 ( rAAV ) 载体。外源基因方式。化学合成或生物方法产生的 RNA 直接用于体内。化学合成的 RNA 还可以经过修饰以增加核酶的体内稳定性。化学合成的核酶 RNA 可以直接加在细胞培养基中或用阳离子脂质体转入细胞。该策略的不利之处是为维持靶 mRNA 的低水平，需要不断投入大量的核酶。(4) 检测体内核酶的生物学活性。可以利用引物延伸、Northern 杂交、RNase 保护试验和 RT-PCR 等方法检测体内靶 mRNA 的表达水平；也可以用特异的方法检测靶 mRNA 编码的蛋白质表达水平。 作为有催化活性的 RNA，发夹型核酶在生物体内的作用是位点特异的核酸酶以及 RNA 连接酶。发夹型核酶的催化基序最先是在烟草环斑病毒负链的卫星 RNA 中发现的，它表现一种可逆的自切割反应，最终使滚环复制的产物形成成熟的病毒核酸。发夹型核酶与锤头型核酶都能催化产物的连接，但是发夹型核酶的催化活性要高得多。而且人们发现发夹型核酶催化连接反应的活性比催化切割反应的活性要高近 10 倍，而锤头型核酶正好相反，它催化自我切割的活性比催化连接反应的活性高 100 倍。 一、材料与设备1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。2. 放射自显影用具。3. 水浴。4. 终止缓冲液：90% 去离子甲酰胺，0.02% 溴酚蓝，15 mmol/L EDTA，50 mmmol/L HEPES-NaOH (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L MgCl2。二、操作方法1. 发夹型核酶的结构发夹型核酶剪切与连接活性的基本结构是核酶中区域 A 和 区域 B 的直接相互作用，每个区域主要由进化上保守的内环与两侧的短双链螺旋构成。核酶的基本结构及其切割位点如图。现在的研究所发现的具有催化活性的发夹型核酶最小的基序为 50 nt，因此可以用固相合成的方法获得发夹型核酶，也可以将修饰的 rNTP 导入核酶以增加其稳定性。2. 催化反应实验(1) 反式剪切实验。剪切反应可以从加入特异的阳离子形成底物-核酶复合体开始并从加入变性剂终止反应而结束；也可以通过把底物加入核酶中来启动反应，此时所有 RNA 均先在折叠终离了浓度下预孵育。典型的剪切反应步骤如下：① 准备 RNA 溶液。终浓度分別为核酶 0.5 μmol/L、32P 标记的底物 RNA (1~2 nmol/L)，50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、0.1 mmol/L EDTA。② 准备阳离子溶液。终浓度分別为 50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、12 mmol/L MgCl2。③ 上述两种溶液先在 25℃ 平衡 5 min，再将两溶液各取 40 μl 混合以启动反应。④ 在 7~12 h 每个时间点取出 3 μl，加入 10 μl 终止缓冲液在冰浴中终止反应。⑤ 20% PAGE-8 mol/L 尿素胶电泳，放射自显影。(2) 连接实验。发夹型核酶可以连接带有 5\'-OH 和 2\'，3\'-环化磷酸末端的 RNA。带有 5\'-OH 未端的 RNA 可以由化学合成或通过转录产物的去磷酸化得到。而带有 2\'，3\'-环化磷酸未端的 RNA 仅能通过对发夹型核酶切割的底物跑胶分离后再切胶回收而得到。连接实验方法与剪切实验方法一致，需要注意的是要保证核酶被剪切产物所饱和。 除锤头型核酶与发夹型核酶以外，还有肝炎 δ 核酶和 Neurospara VS 核酶等小分子核酶。此外，自然界中还存在着大分子核酶，包括 Ⅰ 型内含子、Ⅱ 型内含子和 RNaseP 的 RNA 亚基。 一、材料与设备1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。2. 放射自显影用具。3. 水浴。4. 上样缓冲液：95% 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青。5. RNase T1、RNase U2 ( Amersham Pharmacia 公司）。6. 终止缓冲液：95％ 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青，10 mmol/L EDTA。 二、操作方法1. 双分子 δ 核酶系统的设计(1) 基于肝炎 δ 病毒反义基因组自我剪切基序的反式作用 δ 核酶的结构如图。(2) 以肝炎 δ 核酶的反义作用机制为基础设计出的双分子 δ 核酶的结构如图所示。它由两个分子 RzA 与 RzB 组装而成，RzA 分子作为底物结合部分，可以产生反义效应；RzB 分子则是该双分子 δ 核酶的催化活性所必须的部分。该系统之所以在基因治疗中可能有更多潜在的优势就是因为该核酶具有反义与剪切的双重作用。(3) 双分子 δ 核酶的分子相对较小，可以通过化学合成的方法获得，也可以通过 T7 体外转录的方法获得，此时可将 RzA、RzB 和底物序列的 5\' 端设计为 GGC 或 GGG，放在 T7 启动子后，以获得最大的转录效率。2. RNA 的 T7 体外合成与标记RNA 的 T7 体外合成方法参照 SELEX；32P 末端标记方法参照锤头型核酶的 32P 末端标记程序。3. 确定转录产物的 RNA 序列用消化 RNA-磷酸骨架的核酸酶特异性切割 RNA 以确认转录产物的长度和部分序列。(1) 反应体系共 4 μl。(2) 5\' 末端标记的 RNA (小于 1 nmol/L，50000 CPM )，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NH4CI，1 U/μl RNase T1 ( 消化单链 RNA 上的 GpN )，1 U/μl RNase U2 ( 消化单链 RNA 上的 ApN )。(3) 37℃ 孵育 1~5 min。(4) 加入终止缓冲液 5 μl。(5) RNA ladder：5 μl 体系含 5\' 末端标记的 RNA ( 50000 cpm)、50 mmol/L NaHCO3、 5 mmol/L EDTA，95℃ 放置 5 min。RNA  ladder 用来作为分子质量参照。(6) 根据上述第 (3) 步终止的反应体系与 RNA ladder，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。(7) 放射自显影并分析实验结果。4. 平衡解离常数的测定（可参见 SELEX 第一节的 Kd 部分）(1) RzA-底物复合物的平衡解离常数的测定。9 μl 反应体系，包括 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1-300 nmol/L RzA，少于 0.1 nmol/L 的末端标记的底物 RNA 在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 ；37℃ 预平衡 5 min，加入 1 μl 100 mmol/L MgCl2 开始反应；37℃ 孵育 90 min；加入 2 μl 上样缓冲液；非变性 PAGE (12% 聚丙烯酰胺，45 mmol/L Tris-硼酸，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2 ，10% （V/V）甘油）电泳；放射自显影；分析数据可获得 KdRzA。(2) RzA-RzB 复合物的平衡解离常数的测定同上，0.1~300 nmol/L RzA-小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzB，可以获得 KdRzA；0.1~300 nmol/L RzB 小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzA，可以获得 KdRzB。(3) KdRzB（RzA\' 与 RzB），KdRzA ( RzB\' 与 RzA )，KdRzA（S\' 与 RzA）分别等于标记 RNA 有一半被结合时未标记的另一条 RNA的浓度。5. 剪切反应(1) 平衡解离常数 Kd 的测定结果可以用来估计底物：RzA、RzA-RzB 的比例，但它们的最佳比例仍需通过剪切反应来确定。(2) 剪切反应体系总体积为 18 μl，包括各种浓度的核酶、小于 1 nmol/L 的底物、 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )；在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 min；37℃ 预平衡 5 min，加入 2 μl 0.5 mol/L MgCl2 起始剪切反应；37℃ 孵育 3.5 h 或直至剪切完成；取出反应液 2~3 μl，加入 5 μl 终止缓冲液；20% PAGE-8 mol/L 尿素凝胶电泳；放射自显影。6. 剪切常数 (Kobs) 的测定未标记的底物 RNA ( 1 nmol/L) 与标记 RNA 混合，终浓度 50 nmol/L，核酶浓度 50~500 nmol/L。通过根据将剪切实验数据拟合成等式 At =A（1-e-kt） 来确定剪切常数 (Kobs)，公式中的 At 代表在时间点 t 的剪切率， A 代表最大剪切率或剪切最后的时间点，k 即是剪切常数 (Kobs) 。公式中的每个数据均需要至少两次实验来确定，而且每次实验的数据偏差不得大于 15%。7. 双分子核酶系统对 Mg2+的要求反应体系：MgCl2 ( 1~500 mmol/L )，RzA，RzB ( RzA : RzB=1 : 3，即分别为 50 与 150 mmol/L)，底物 RNA ( 50 nmol/L)。计算最大剪切速度一半时的 Mg2+ 浓度。 您知悉并同意，丁香通平台展示产品并非为平台自身产品，您发起询价或试用申请后，平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家，由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买，因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝，但您知悉将无法参加询价或试用活动。